<%=NSW.OConfig.GlobalConfig.SiteName %>
歡迎訪問西寶生物官網 ! 股票代碼:837709

西寶生物

西寶生物中國生命科學領域優選服務商!

全國服務熱線:400-021-8158

24小時短信服務: 13917439331

您是否在搜:巖藻糖 | 修飾性PEG | 維生素K2 | 瑪卡提取物 | 食品安全 | 二噁英檢測

當前位置:首頁 » 資訊中心 » 生命科學

【外泌體純化】新型親和法外泌體提取試劑盒 ——MagCapture 外泌體提取試劑盒PS

來源:作者:人氣:-發表時間:2019-11-07 10:31:00【
內毒素檢測耗材
MagCapture™外泌體提取試劑盒 PS采用磷酯酰絲氨酸(PS)親和Tim4蛋白固化磁珠(PS親和法)的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細胞外囊泡(EVs)。如果想要得到更高純度的外泌體,請使用10,000×g離心后的上清。西寶生物作為Wako指定國內經銷商可提供外泌體研究整體解決方案,咨詢請撥打400-021-8158
該試劑盒使用含有EDTA的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來,所提取的完整外泌體和其他EVs可用于不同實驗,包括電鏡分析(TEM)、納米粒子追蹤(NTA)分析、投喂實驗、分子組成(蛋白質、脂質、核酸等)分析等。
膜表面磷酯酰絲氨酸(PS)親和法
免疫系統中外泌體的組成分子
Tim4蛋白固化磁珠,在金屬離子存在的條件下親和細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸(PS),然后使用含有EDTA的洗脫液進行洗脫,捕獲高純度的完整細胞外囊泡
優點 & 特色
使用新型親和提取方法
  ● 通過PS親和分子回收
  ● 低背景值
  ● 在中性條件下通過螯合試劑進行溫和洗脫
  ※ 可獲得高純度,完整的外泌體
無需進行超離
  ● 使用磁珠改進了操作
  ● 流程優化
  ※ 高重復性
與其他提取方法相比
方法
外囊泡純度
囊泡狀態
可操作性
回收量
PS親和法
■■■
完整
簡便穩定
■■■
超速離心法
■■
完整
簡便
■■
聚合物沉淀法
完整
簡便快捷
■■■■
密度梯度離心法
■■■■
完整
復雜
■■
抗體親和法
■■■
不完整
簡便穩定
■■
樣品類型:細胞培養上清、血清、血漿、尿液等。
  ● 可以純化高純度和完整的細胞外囊泡
  ● 可以從細胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡
  ● 重復性高,回收量穩定
  ● 簡易操作(約3.5小時)
  ● 啟用多個樣品(無需超速離心)
產品列表
產品名稱
包裝規格
保存條件
MagCapture™Exosome Isolation Kit PS
10次
(產品編號:293-77601)
2次
(產品編號:299-77603)
2-10°C
試劑盒成分
(1)鏈霉親和素磁珠
(2)生物素標記的外泌體捕獲
(3)外泌體捕獲免疫固定緩沖液
(4)外泌體結合增強劑(×500)
(5)洗滌緩沖液
(6)外泌體洗脫緩沖液
(7)反應管
<10 次>
 600 μL×1 管
 100 μL×1 管
 35 mL×1 瓶
 500 μL×1 管
 75 mL×2 瓶
 5 mL×1 瓶
 22 管
<2 次>
 120 μL×1 管
 20 μL×1 管
 7 mL×1 瓶
 100 μL×1 管
 1 mL×1 瓶
 1 管
*每套試劑盒能完成5次回收實驗,即實際使用量為10×5次/Kit與2×5次/Kit
案列*應用  
從血清、血漿、尿液中提取的細胞外囊泡的分析
從人血清中提取外泌體的產量比較
使用該試劑盒,超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體,接著用CD9和CD63抗體進行免疫印跡實驗。
● 檢測抗體
抗CD9兔多抗,System Bioscience公司
抗CD63兔多抗,System Bioscience公司
● 免疫印跡(WB)數據
從人EDTA血漿中提取外泌體
分別從1mL的EDTA血漿、EDTA血漿(超濾更換緩沖液)、人血清中提取外泌體,進行WB檢測(抗Flotillin2抗體)。
● 檢測抗體
抗Flotillin-2小鼠單抗(29/Fotillin-2),BD Bioscience公司
● 使用樣品量
各1mL
各樣品結果分別對應150μL樣品量。從100μL提取物中取出15μL,添加5μL的4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。
從人尿液中提取外泌體的回收量比較
1mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進行外泌體回收,并做免疫印跡(WB)檢測(抗CD9抗體)。
● 檢測抗體
抗CD9兔多抗,System Biosciences公司
● 使用樣品量
各1mL
● 免疫印跡(WB)數據
各樣品結果分別對應150 μL尿液樣品。從100 μL提取物中取出15 μL,加入5 μL的 4×SDS樣品緩沖液,全部上樣。
與傳統沉淀法的功能比較實驗:
分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562(人慢性骨髓性白血病)細胞培養上清(無血清培養上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養基)提取外泌體,分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】
按照試劑盒的操作說明(反應時間:3小時),從1 mL經過離心處理(10,000×g,30min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)中提取外泌體。
超速離心法
將10 mL經過離心處理(10,000×g,30 min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)進行超離(110,000×g,70 min),用TBS緩沖液重懸沉淀物后,再進行超離(110,000×g,70 min),回收沉淀部分。
聚合物沉淀法
從1mL經過離心處理(10,000×g,30 min)的K562細胞培養上清(無血清培養基或10% Exosome-depleted FBS添加培養基※1)中,按照市售的A公司產品的操作說明(靜置時間:過夜)提取外泌體。
※1:110,000×g離心2小時,在不吸到沉淀的前提下回收上清。
比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡(TEM)分析結果和納米粒子追蹤(NTA)分析結果
分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體,用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外,用最終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段(2~4×1010 particles),在透射電子顯微鏡進行分析。 
電子顯微鏡圖像 數據提供:金澤大學 醫學系 華山教授、大阪大學 iFReC 中井先生
MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子,在透射電子顯微鏡中也可以確認到很多細胞外囊泡。
K562細胞培養上清提取的外泌體回收量和純度的比較(無血清培養基)
用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細胞培養上清(無血清培養基)獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和WB法(CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體)進行實驗。
*回收量,不是回收率
● 檢測抗體
  抗CD63小鼠單抗(MEM-259)
  抗Flotillin-2 小鼠單抗(29/Flotillin-2),BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠單抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司
K562細胞培養上清提取外泌體的回收量和純度的比較(10%FBS-添加培養基)
用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒、超離法和聚合物沉淀法,從K562 細胞培養上清(10% 去外泌體 FBS補充培養基)獲得樣品進行電泳,用銀染法和WB法(CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體)進行實驗。同時,對外泌體提取片段進行質譜測定,比較所有測定的多肽中來自K562細胞的人來源多肽的比例(由于添加到細胞培養基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的,所以人來源多肽的比率會下降)。
● 檢測抗體
  抗CD63小鼠單抗(MEM-259)
  抗Flotillin-2小鼠單抗 (29/Flotillin-2),BD Bioscience公司
  抗Lamp-1小鼠單抗(25/Lamp-1),BD Bioscience公司
  健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較
實驗數據
①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量
通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離,然后使用microRNA提取試劑盒(產品編號295-71701)提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
相比超離法,PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產量。
②運用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較
運用PS親和法將EVs從正常人血清中分離,然后使用microRNA提取試劑盒(產品編號295-71701)或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA,并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。
對比AGPC法,使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA
外泌體蛋白質組學分析
<實驗內容及結果>
分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法,從含10% FBS(不含外泌體)的K562細胞培養上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離,剪切出全部的蛋白質條帶。然后在凝膠內進行消化,用LC-MS對蛋白質進行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進行蛋白質組合的相關性比較。
比較通過MASS分析鑒定的前10個蛋白質
白色柱:源自外囊泡的人類蛋白質
灰色柱:來自FBS的牛蛋白污染物
紅 色:來自外囊泡的標記蛋白
樣品:K562細胞培養基(含有10%去除外泌體胎牛血清)
 
PS親和法
超離法
聚合物沉淀法
1
71 kDa熱休克同源蛋白
(Heat shock cognate 71kDa protein)
DNA依賴蛋白激酶催化亞基基因
(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)
補體C3
(Complement C3)
2
膜聯蛋白A6
(Annexin A6)
鐵轉蛋白受體1
(Transferrin receptor protein1)
α2-巨球蛋
(Alpha-2-macroglobulin)
3
鐵轉蛋白受體1
(Transferrin receptor protein1)
血清白蛋白
(Serum albumin)
纖連蛋白
(Fibronectin)
4
V-ATP酶A亞基
(V-type proton ATpase catalytic subunit A)
ATP依賴RNA解旋酶
(ATP-dependent RNA helicase A)
血清白蛋白
(Serum albumin)
5
浮艦蛋白-2
(Flotillin-2)
微管蛋白β5
(Tubulin beta-5 chain)
血小板反應蛋白-1
(Thrombospondin-1)
6
程序性細胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)
71 kDa熱休克同源蛋白
(Heat shock cognate 71 kDa protein)
補體C4
(Complement C4)
7
細胞表面抗原4F2重鏈
(4F2 cell-surface antigen heavy chain )
脂肪酸合成酶
(Fatty acid synthase)
α-1抗蛋白酶
(Alpha-1-antiproteinase)
8
膜聯蛋白A1
(Annexin A1)
細胞表面抗原4F2重鏈
(4F2 cell-surface antigen heavy chain)
載脂蛋白-β-100
(Apolipoprotein-β-100)
9
220kDa激酶D相互作用底物
(Kinase D-interacting substrate of 220kDa)
U5小核核糖核蛋白的解旋酶
(U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)
胎兒血紅蛋白亞單位
(Hemoglobin fetal subunit beta)
10
膜聯蛋白A2
(Annexin A2)
β4微管蛋白
(Tubulin beta-4B chain)
β5微管蛋白
(Tubulin beta-5 chain)
成對組合相關性比較
應用數據
Protein Assay BCA Kit檢測外泌體的蛋白質濃度
Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸(BCA)定量檢測溶液中的蛋白質濃度的試劑盒,是蛋白質定量檢測法中最通用的方法。其原理為,堿性條件下的蛋白質Cu2+離子被還原為Cu+。Cu+與BCA形成絡合物,即產生紫色螯合物,蛋白質濃度與紫色螯合物顏色深淺有關,通過測定562 nm處的吸光度,并與標準曲線做比照,即可定量溶液中的蛋白質濃度。
利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細胞培養上清液中提取外泌體,通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質濃度。
【實驗內容及結果】
將通過MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的25 μL外泌體溶液分注于96孔板中,加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200 μL。之后60℃孵育30分鐘,檢測560 nm吸光度(圖1)。結果表明,通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測,可測定提取后外泌體中蛋白質濃度。

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質濃度的檢測
由于外泌體蛋白質濃度相當低,因此BCA測定時不要稀釋樣品。
① 將BSA標準溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL和空白對照,分別每孔25 μL加到96孔板中。
② 分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液(空白)按照每孔25 μL加入96孔板。
③ 把200μL Protein Assay BCA Kit(產品編號:297-73101)的試劑A盒試劑B混合液(A:B=50:1)加入放有樣品的孔板中。
④ 60℃孵育30分鐘
⑤ 室溫條件下降低孔板溫度
⑥ 測定560 nm的吸光度
產品編號
產品名稱
包裝
訂購熱線:400-021-8158
297-73101
Protein Assay BCA Kit
蛋白測定試劑盒(二喹啉甲酸)
250次用
015-25613
2mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum
2mg/mL 牛血清蛋白溶液
1 mL×10
外泌體的標記和Hela細胞導入實驗
【實驗概要】
用PKH67(Sigma公司)標記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細胞外囊泡,Hela細胞導入確認
<外泌體PKH67標記>
1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體(實驗當天從K562細胞培養上清液提取外泌體)
2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質濃度和粒子濃度
3. 將相當于5 μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。
*請配制合適的使用量
4. 將2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*
*請配制合適的使用量
5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中,混合后在室溫中孵育5-10分鐘。
6. 根據附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo公司)。
7. 將100 μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉柱*中,離心(最大添加量:100 μL)。
*準備必需的支數。
8. 將外泌體溶液*加入到已經接種好Hela細胞的培養皿中,24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細胞儀進行分析。
*根據實驗調節外泌體添加量

圖1. PKH標記外泌體的細胞捕獲觀察
從16 mL K562培養上清液中超濾濃縮得到4 mL培養上清液作為樣品,通過PS親和法提取外泌體。
● 提取的外泌體蛋白質濃度:22.3 ng/μL
● 粒子濃度:1.2×108 particles/mL
將上述標記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細胞中,24小時后用熒光顯微鏡(左)和流式細胞儀(右)檢測捕獲情況。
Opti-MEM:取相同量用PKH標記后添加到細胞中作為陰性對照。
細胞培養上清•血清•血漿的預處理操作
樣品預處理:對樣品進行1,200×g離心操作※1。如果要得到更高純度的外泌體,則按照下述步驟對樣品進行10,000×g離心操作※2。
下文是細胞培養上清、血清/血漿的預處理方法。其他體液樣品的預處理操作,請參考血清/血漿的實驗步驟,做適當調整。
更換緩沖液(限制過濾)操作
用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經經過離心處理的EDTA 血漿樣品進行緩沖液更換。
1. 把19 mL TBS 加進VivaSpin20(100K)中。
2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20(100K)中,混勻。
3. 把第2. 的VivaSpin20(100K)在4℃下進行離心處理。
4. 減少上線的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 緩沖液。
5. 4℃下離心處理。
6. 減少上面的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加10 mL TBS 緩沖液。
7. 4℃下離心處理。
8. 減少上面的液體后,在VivaSpin20(100K)中追加11 mL TBS 緩沖液。
9. 4℃下離心處理直至樣品液量達到1 mL 以下。
10. 進行提取。
MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 操作步驟
MagCapture™ 外泌體產品
貨號
品名
規格
咨詢訂購熱線:400-021-8158
293-77601
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
Exosome外泌體提取試劑盒PS
10次用
299-77603
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
Exosome外泌體提取試劑盒PS
2次用
016-27061
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)
抗CD63單抗(3-13)
20ul
012-27063
Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)
抗CD63單抗(3-13)
100ul
290-35591
Magnet Stand
MagCapture系列磁珠捕獲用磁力架
1個
297-79201
PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)
PS Capture™外泌體ELISA試劑盒(抗小鼠IgG POD)
96 次
297-79701
PS Capture™ Exosome Flow Cytometry Kit
PS Capture™外泌體流式試劑盒
300 次
更多產品詳情可登錄西寶商城查詢!

西寶生物科技(上海)股份有限公司      全國統一服務熱線:400-021-8158
地址:上海國際醫學園區芙蓉花路118弄2號樓(201321)
西寶生物官網二維碼
總機:+86 21 50272975/76/77/78/81
傳真:021-50272982
官網: www.zakfct.tw
微信服務號:iseebio
微信訂閱號:seebiotech
銷售:張經理
客服:
技術支持: 劉經理
手機/微信號:18301863121
手機/微信號: 13917439331
固話分機:6615
QQ:2102259500
微信號:iseebio
微信號:17717616967
西寶生物大樓
西寶生物科技(上海)股份有限公司(837709.OC),2003 年成立于張江高科技園區,現已成為生命科學領域集研發、生產、貿易、進出口、技術服務一體化的綜合服務商。西寶生物主營包括IVD原料,科研試劑,新材料和健康產品四大板塊和服務。除自營Seebio和Canmedo(康美多)、泉養堂、五藏養生品牌外,西寶生物代理了Wako、APSC、Jackson、Ludger、Bioporto、Lumiprobe、Aalto等知名品牌。西寶生物正致力于分子診斷、轉化醫學、干細胞、抗衰老等研發領域,依托產學研創新平臺,打造大健康產業鏈,以持續不竭的技術創新、穩定可靠的優質產品和專業便捷的技術服務,提供更具價值、創新性和定制化的綜合解決方案,與您攜手共創美好的明天。
西寶生物官網二維碼 西寶生物微信服務號:iseebio 西寶生物微博:seebiobiotech
官網:www.zakfct.tw 微信服務號:iseebio 微博:seebiobiotech
西寶商城二維碼 mall.seebio.cn 微信訂閱號:seebiotech 泉養堂官網:www.canmedo.com
商城:mall.seebio.cn 微信訂閱號:seebiotech 泉養堂:www.canmedo.com
广东快乐10分助手