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【外泌體科普4】外泌體與蛋白質組解析

來源:作者:人氣:-發表時間:2019-11-07 10:03:00【
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外泌體是一種微分泌囊泡。它是細胞內囊泡轉運的產物之一,具有將不需要的分子釋放出細胞外、并將內含分子運輸和傳遞到遠端細胞的功能。通常,外泌體具有直徑為幾十至一百納米的脂質雙分子層結構,與細胞結構成分相比,特定蛋白質組(四次跨膜蛋白超家族,Rab家族,Tsg101,Alix等)和miRNA的含量特別多。然而,有研究結果指出,通過細分粒徑進行組學分析時,發現特定粒徑的分子結構明顯不同,所以如今外泌體的分子生物學定義仍未明確。事實上,有不少報道認為通過使用各種不同的外泌體提取方法(使用提取純度不同的外泌體樣本)進行的功能分析實驗發現,外泌體參與癌癥轉移、腫瘤浸潤、血管新生、免疫細胞調節等現象。
另一方面, "從釋放到外周血等體液中的、來自致病細胞的外泌體中,可以讀取致病細胞的分子譜"這一點已被證實了。以診斷為目的外泌體應用已經商業化。例如,在CLIA(Clinical Laboratory Improvement Amendments)認證的實驗室開發的,通過尿液中的外泌體同時檢測前列腺癌特異性PCA3非編碼RNA,ERG mRNA,SPDEF mRNA的測試(ExoDx® Prostate IntelliScore),并且可以作為LDT(Laboratory Developed Tests:實驗室內部研發、驗證、使用的體外診斷測試)進行國際委托技術服務。此外,Wako還建立了一項從血漿中一步分離外泌體DNA/RNA及cfDNA(circulating free DNA)的技術,并發表了一項從血液樣本中檢測非小細胞肺癌EGFR-T790M突變的檢測方法(ExoDx® EGFRT 790 M)。該突變導致60%接受EGFR抑制劑治療的肺癌患者產生耐藥性。有這種EGFR突變,就應及時替換Osimertinib等有效藥物進行治療,故快速的耐藥診斷非常重要。通過對210例EGFR突變肺癌患者的對比試驗,目前認可的cfDNA診斷法(cobas® EGFR Mutation Test v2)檢測T790M的靈敏度是58%,特異性是80%;而ExoDx® EGFR T790M 檢測的靈敏度是92%,特異性是89%。相比之下,ExoDx® EGFR T790M 檢測可獲得更好的診斷結果。
在此背景下,無論是基礎生物學研究還是臨床應用,都需要實驗室之間能夠零差異再現的高純度外泌體,一種任何人能輕松分離和純化外泌體的工具是不可或缺的。特別是,如果研究對象是從血清和血漿樣本中提取純化的外泌體蛋白,則需要非常高的純化水平。血清·血漿的蛋白濃度超過60mg/mL,還存在許多高分子量復合物如脂蛋白,即使是外泌體提取常用的超速離心沉淀法,仍然會存在大量血清游離蛋白(IgM,α2 -巨球蛋白,補體成分等)和脂蛋白。因此,通過LC/MS對超速離心法提取的血清蛋白進行全面定量蛋白質組分析時,幾乎所有含量都是血清游離蛋白,只檢測出了微量的外泌體蛋白。
除超速離心法外,外泌體的提取方法還有抗體親和法、聚合物沉淀法、凝膠過濾法以及從切除的組織浸液中直接回收的方法等。MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS(下文稱為MagCapture試劑盒)的原理是親和純化磷酯酰絲氨酸PS (磷酯酰絲氨酸是構成外泌體膜的脂質之一)。與其它方法相比具有各種各樣的優點。固定在磁珠上的Tim-4蛋白與PS在鈣離子存在的條件下結合,通過螯合劑洗脫,可以不洗脫非特異性磁珠結合蛋白而特異性洗脫外泌體,因此提取的純度很高。另外,只要磁珠純化操作可以順利進行,就不受樣本容量的限制,即使是用稀釋的樣本也同樣有效。此外,由于在沒有變性溶解的情況下進行洗脫,后續的粒子計數檢測、顯微鏡檢查和細胞給藥實驗等應用均可放心使用。
根據圖1A的方法,從相同血清中提取外泌體,并通過Orbitrap Fusion Lumos質譜儀進行綜合蛋白質組分析。結果顯示,超速離心提取外泌體的總蛋白質鑒定數為612種,MagCapture試劑盒提取外泌體的總蛋白質鑒定數為1,103種,后者是前者的約1.8倍(圖1B)。這是因為超速離心法的血清中殘留大量的游離蛋白質,掩蓋了微量外泌體來源的信號。此外,比較鑒定的蛋白質以及相對定量值,可以看出,MagCapture試劑盒提取的外泌體中,被認為是外泌體標記蛋白的恒定分子組合以及相對含量都要更多(圖2)。由此可見,通過試劑盒提取的外泌體純度遠高于現有的超速離心沉淀法。
使用高純度的外泌體,有利于闡明外泌體的功能以及探索診斷和治療藥物,使研究結果更具可信度。從外泌體提取的純度、靈活性、可重復性等方面來看,MagCapture試劑盒適合作為所有外泌體研究的起點。但是,通過該試劑盒回收的產物也是一組含有大量PS膜組分的無限定尺寸的集合,是否等同于其他現有研究指出的外泌體,還需要后期的組學分析來進行仔細評估和定義。隨著包括MagCapture試劑盒在內的提取純化技術以及檢測技術的發展,我們期待對外泌體的本質闡明和臨床應用的進一步發展。
提取純度對外泌體蛋白質組分析的影響
圖1. 提取純度對外泌體蛋白質組分析的影響
A)通過超速離心沉淀法和MagCapture™Exosome Isolation Kit PS提取血清中的外泌體并進行質譜分析
B)鑒定出的蛋白數量和重疊部分
鑒定外泌體蛋白質的定量頂視圖
圖2. 鑒定外泌體蛋白質的定量頂視圖
A) MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS及B)超速離心沉淀法提取血清中外泌體的蛋白質組定量分析結果
B)收集并記錄了有報道作為外泌體標記物的蛋白。
公益基金會癌癥研究小組 植田 幸嗣
參考文獻:
[1]
Zhang, H. et al. :"Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation", Nat. Cell Biol., 20, 332(2018).
[2]
McKiernan, J. et al . :"A Novel Urine Exosome Gene Expression Assay to Predict High-grade Prostate Cancer at Initial Biopsy", JAMA. Oncol., 2, 882(2016).
[3]
Castellanos-Rizaldos, E. et al . :"Exosomebased Detection of EGFR T790M in Plasma from Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Clin. Cancer Res ., DOI : 10.1158/1078-0432. CCR-17-3369(2018).
[4]
植田幸嗣:「プロテオーム解析から見たバイ オマーカーとしてのエクソソームとその特 徴」, 細胞工學, 32, 71(2013).
[5]
Jingushi, K. et al. :"Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin", Int. J. Cancer , 142, 607(2018).
公益基金會癌癥研究小組 植田 幸嗣
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