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內毒素檢測知多少(上篇)

來源:作者:人氣:-發表時間:2019-10-28 14:08:00【
內毒素endotoxin)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分,叫做脂多糖。脂多糖對宿主是有毒性的。內毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后才釋放出來,所以叫做內毒素。
腸道桿菌多為革蘭氏陰性桿菌,具有內毒素,若引起敗血癥、腦膜炎等感染時,可用血液、腦脊液及體液等檢測內毒素,以協助臨床診斷。另外,在生產藥劑等過程中,自然環境中產生內毒素的細菌也常污染注射制劑、生物制品等,出廠前也要嚴格檢查。內毒素的檢測在現代臨床生物技術中越發顯得重要,西寶生物作為Wako的一級代理商致力于生命科學領域十多年,可為廣大客戶提供內毒素檢測的整體解決方案,從儀器設備和相關試劑和耗材等
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【什么是內毒素】
內毒素一種在革蘭氏陰性菌細胞壁中發現的脂多糖(LPS)。它是一種典型的熱原,哪怕是皮克級(10-12g)或納克級的(10-9g)內毒素進入血液,也會引發各種生物反應。因為其有著耐熱性和穩定性,通過高壓蒸汽處理也不能完全使內毒素滅活,需在250℃或以上的溫度下,干熱處理至少半小時才能使其滅活。它存在于革蘭氏陰性菌棲息的環境中(例如水,空氣),即使在細菌死亡后,細菌性的內毒素(LPS)仍然存在。
圖1. 脂多糖(LPS)結構示意圖
圖1為脂多糖的結構圖如圖所示,脂質A在該物質中是負責生物活性的主要部分,這部分的分子量約為2000。包含糖鏈部分在內的整個分子的分子量一般為5000到8000左右。然而,因為內毒素是一種同時擁有親水區(糖鏈)和疏水區(脂質A)的分子,它能在水溶液中相互締合,形成表觀分子量為數十至數百萬的膠束結構。有報告指出,膠束結構的變化,會影響其生物活性的強弱。
圖2. 脂質A的結構(大腸桿菌型和沙門氏菌型)
圖2所示為大腸桿菌型和沙門氏菌型的脂質A的結構。從圖中能看出即使菌株不一樣,脂質A的基本結構在大體上仍然相同。
【使用鰲阿米巴樣細胞溶解物(LAL)試劑的各種內毒素檢測方法】
由馬蹄蟹(美洲鱟)的阿米巴樣細胞溶解物制備的試劑可用于檢測細菌內毒素。如圖3所示,在內毒素的參與下,級聯反應開始進行,其中C因子,一種絲氨酸蛋白酶前體,最先被活化。隨后接下來的是B因子的活化,B因子也是一種絲氨酸蛋白酶前體和凝固酶前體,它能將凝集原水解成凝集素,形成不溶性凝膠。
在LAL測試中,內毒素可以通過三種方式定量:
  1. 對凝膠的形成進行測定
  2. 對濁度的增加進行測定
  3. 或對由合成底物分解而釋放出的黃色色原體進行測定。
普通的LAL試劑不僅與內毒素反應,而且會與(1→3)-β-D-葡聚糖(真菌細胞壁成分)反應,因為G因子途徑會在LAL試劑作用下被激活。為了消除這種(1→3)-β-D-葡聚糖活化,在工業中通過去除G因子或抑制其活化,開發了各種內毒素特異性試劑。
市場上有著各種基于圖3中的反應機理所制得的LAL試劑以及檢測體系。因此,根據所需的準確度、測試頻率、樣本數目以及其他相關因素來選擇最合適的產品是十分重要的。
圖3. LAL試劑反應機理
美國,歐洲和日本的藥典中包含了三種內毒素檢測方法,分別是凝膠法、比色法和比濁法,我們會在下面的章節中詳述,并且會介紹相關的LAL試劑的特點以及其應用實例。
(1) 凝膠法
將樣本與LAL試劑在試管中混合,并使用干浴器,在37±1°C下,孵育60±2 min,期間不要振動。加熱完成后,立即緩慢地將試管傾斜180°。如果凝膠已形成并能保持其完整性而不變形或塌陷,則結果可確定為陽性,而如果未形成凝膠則為陰性。在檢測期間,對于一系列樣本,要進行多倍稀釋(通常為2倍),以檢查每個樣品的結果是否為陽性。確定為陽性的最大有效稀釋倍數或最小濃度被稱為終點。
相關試劑:
在單次型試劑盒和多次型試劑盒中都包含LAL試劑,其中單次型試劑盒中的反應小瓶包含了預分裝好的用于單次檢測的LAL試劑,而多次型試劑盒則是將所需量的已經溶解好的LAL試劑裝入到反應瓶中。單次型試劑盒非常適用于少量樣品的檢測,而多次型試劑盒則適用于樣本量更多的檢測。
多次型試劑盒的使用方法式是將0.1 mL已經溶解好的LAL試劑分裝到反應管中,然后再加入0.1 mL樣品,并將其混合。而單次型試劑盒的使用方法則是將0.2 mL樣本加入到含有預先分裝好的LAL凍干試劑的反應小瓶中。
ES-II系列
特異性內毒素LAL試劑(不會被(1→3)-β-D-葡聚糖活化),與細菌內毒素檢測(BET)(日本藥典)相兼容。其膠凝靈敏度為0.015 EU/mL,單次型和多次型試劑盒均有提供。
(2)比色法
由于內毒素會使LAL試劑活化,比色法是根據其對顯色底物的分解來檢測其活化。由于對硝基苯胺的黃色的吸光度是在405 nm波長下檢測的,如果樣品在約405 nm波長下具有相當大的光吸收,則不宜使用比色法。
相關試劑
Color KY 系列
內毒素特異性比色法LAL試劑,與BET(日本藥典)一致性測試相兼容。與Toxinometer® 結合使用的單次型試劑盒,以及與酶標儀和Toxinometer® 結合使用的多次型試劑盒,可用于動態比色測試。這些系列在我們的試劑產品有著最高的靈敏度:檢測限為0.0002 EU/mL(單次型)和0.0005 EU/mL(多次型)。
(3)比濁法
比濁法利用凝膠濁度的變化來檢測由內毒素誘導所產生的LAL試劑的活化。它不適用于具有一定濁度的樣品。
ES-F系列和ES-II系列
在動態比濁法測量中,可以將ES-F系列、ES-II系列與酶標儀和Toxinometer® 結合使用。這些試劑盒不僅能獲得凝膠法的結果,同時能得到動態比濁法的數據,測量時間為60 min。
【對檢測用具的要求】
用于內毒素檢測的所有檢測用具必須不含內毒素和β-葡聚糖。為使內毒素失活,需要在250°C下干熱處理超過30 min。建議使用經干熱滅菌的玻璃器皿。避免使用金屬工具,因為即使有少量被洗脫出的金屬離子(例如鐵,鋁,鎵,鉻),也可能影響測試。而當使用一次性塑料工具(其制造商未能保證其能用于檢測用途)時,檢查它們是否滿足以下要求(與玻璃器皿相比):1)未被內毒素污染; 2)不吸附內毒素; 3)無洗脫物。
【內毒素產品列表】
貨號
品名
規格
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR (TM) ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL Reagent vials + 1 CSE vial)
鱟阿米巴樣細胞裂解物PYROSTAR™ES-F單次測試 靈敏度0.015 EU/mL
25 tests
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F MULTI TEST (without CSE)
鱟阿米巴樣細胞裂解物PYROSTAR™ES-F多次測試(不含CSE)
100 tests
Limulus ES-2 Single Test wako
鱟試劑ES-2 Single(適用于溶膠凝膠法和動態比濁法)
25 tests
Limulus ES-2 Test wako
鱟試劑ES-2 (適用于溶膠凝膠法和動態比濁法)
60 tests
Limulus Amebocyte Lysate ES-II, Lyophilized
鱟試劑LAL ES-II(適用于溶膠凝膠法和動態比濁法)
2 ml×5
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (with CSE)
鱟阿米巴樣細胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板(含CSE)
160 tests
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (without CSE)
鱟阿米巴樣細胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板(不含CSE)
200 tests
Limulus Color KY Single Test wako
鱟試劑比色法KY單次測試
25 tests
Limulus Color KY Test Wako
鱟試劑比色法KY多次型
60 tests
290-33771
Toxinometer ET-6000/J Standard Set
內毒素檢測儀ET-6000/J
1 set
291-35761
Toxinometer ET-7000/J Standard Set
內毒素檢測儀ET-7000/J(升級版)
1 set
※ 上述產品僅供實驗使用,不可用于臨床診斷。
未完待續,欲了解更多內毒素相關的精彩內容請關注西寶官網,留意下次發布的文章《什么是內毒素?(下篇)》
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